本文摘要：洗手级身体健康雄性SD大白鼠60只,体重为(240±10)g,纯白色,由湖北省动物实验中心获取,合格证号：SCXK(鄂)2008-0005。

洗手级身体健康雄性SD大白鼠60只,体重为(240±10)g,纯白色,由湖北省动物实验中心获取,合格证号：SCXK(鄂)2008-0005。实验前7天将售予的60只身体健康雄性SD大鼠适应性喂食于实验环境中,室温维持在20℃一25℃。然后将其随机分成长时间组、模型组、中药组、激素组、中药+激素两组5两组,每组各12只。

手术前一天,对大鼠颈部行脱毛及备皮处置。手术开始后,首先将大鼠用提炼好的3.5%水合氯醛(lOml/kg)麻醉后站立相同于35度弯曲手术板上,使大鼠咽喉部皮肤曝露在光源下,缝合颈部皮肤,用血管钳钝性分离出气管,用1ml注射器在环状软骨间刺穿气管腔,返放,有气体则较慢流经BLMA5(5mg/kg),静脉注射完后很快将手术板矗立并转动,使药物尽量均匀分布在大鼠肺内,然后逐级穿孔肌层及皮肤,消毒。

法术毕,不予静脉注射青霉素(8万u/天,持续静脉注射3天)防治病毒感染,待动物精神状态后权利喂食。另外长时间组大鼠,气管内流经的为等体积生理盐水,其它操作者同上述造模法。造模后第28天,开始灌胃给药,倒数给药28天,给药剂量由成人每日常规服药量折算而出。①长时间组：生理盐水2ml,灌胃,每日一次；②模型组：生理盐水2ml,灌胃,每日一次；③中药组：提炼好的中药不予1ml/100g体重,灌胃,每日一次；④激素组：将提炼好的浓度为35%的醋酸泼尼松溶液不予1ml/100g体重,灌胃,每日一次；⑤中药+激素组：将提炼好的中药+激素混合溶液不予1ml/100g体重,灌胃,每日一次；以上各组大鼠皆置放完全相同实验环境下圈养,室温维持在20℃一25℃,权利喂食,饮水,于灌胃后第14、28天分批处决。

提炼好的3.5%水合氯醛溶液(现配)腹腔静脉注射麻醉大鼠,发狂处决,相同在手术板上,曝露胸腔,缝合皮肤,逐级分离出来肌层,绑肋骨,原始分离出肺的组织。所取左肺下叶一部分的组织洗净在准备好的10%中性甲醛溶液中,常规水解、浸蜡、包埋,切片后展开HE染色及Masson染色仔细观察肺的组织形态学转变。

同时所取右肺底一部分的组织重复使用DEPC水处理后的4%多聚甲醛溶液中及时相同,常规水解、浸蜡、包埋,切片后行原位杂交法检测肺的组织中TNF-a、TGF-β1、IFN-r的传达。仔细观察并记录各组大鼠饮食、饮水、皮毛、精神状况、二之后、体重以及丧生情况等。(1)肺的组织形态学仔细观察1)肉眼仔细观察各组大鼠肺的组织外观形态发狂处决大鼠后,肉眼仔细观察分离出的原始肺的组织外观形态。

2)肺病理组织学仔细观察将相同好的大鼠左肺下叶行HE染色及Masson染色仔细观察肺的组织形态学转变。HE染色法：①取材于,无法太大太厚,最差为24×24×2mm；②包埋；③切片,厚度5～10um间,深浅均匀分布,无皱褶无刀痕；④石蜡切片经常规脱蜡至水；⑤水洗；⑥疮苏木素3－5分钟；⑦分化；⑧于碱水中抵绿20数秒；⑨伊红染色10－20秒；⑩水解,半透明,中性树胶封固,镜检。

Masson染色法：①石蜡切片脱腊；②梯度进水：95%、70%、30%乙醇各漂洗2分钟,蒸馏水2分钟；③燥水漂洗：于30-40℃燥水中漂洗,每次30-60秒,一共2次；④于蒸馏水润湿玻片30-60秒；⑤R1核染液染色1分钟左右,推倒扔,冲洗液冲洗30数秒；⑥R2浆染液染色1分钟数秒,推倒扔,冲洗液冲洗30数秒；(R2染色时间不应过于宽否则可造成胞浆着色过浅,使R3变黄效果不欠佳)⑦R3黄色分色液分色6-8分钟左右(于镜下仔细观察标本中胶原纤维部分变黄成淡粉红色为宜。如果变黄效果不欠佳,可必要调整分色时间,以便让胶原纤维更加不易着色)。弃去分色液。(需要冲洗)⑧用R4蓝色始染液复染5分钟左右,推倒扔,然后用无水乙醇冲洗。

⑨吹干,封片,镜检。(2)原位杂交法检测肺的组织中TNF-a、TGF-β1、IFN-r的传达将相同在提炼而出的相同液{4%多聚甲醛/0.1MPBS(PH7.0-7.6),所含1/1000DEPC}中的右肺的组织相同完后按特例步骤展开处置：①常规水解、浸蜡、包埋。冰冻后切片,切片厚度6-8μm；②玻片的处置：玻片(还包括盖玻片和载玻片)应用于热肥皂水冲洗,再行用蒸馏水冲洗,洗涤后,置放清洁液中洗净24h,然后蒸馏水洗涤浸泡,用95%酒精洗净24h后蒸馏水冲洗,用烘箱浸泡(温度最差在150℃及以上,过夜以便除去RNA酶)；③石蜡切片经常规脱蜡至水。

30%H2O21份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗净3次；④曝露mRNA核酸片段：在切片上滴加提炼好的3%柠檬酸新鲜溶解后的胃蛋白酶(由1ml3%柠檬酸和2液稀释型胃蛋白酶混匀而出),在37℃或室温下消化30分钟左右。原位杂交用PBS洗净3次×5分钟。

然后蒸馏水浸1次；⑤后相同：此为关键步骤,待胃蛋白酶消化好后再行用提炼而出的相同液{1%多聚甲醛/0.1MPBS(PH7.2-7.6),所含1/1000DEPC}在室温下相同10分钟,蒸馏水冲洗3次。⑥实杂交：将打算的湿盒洗涤后晒干,然后向其底部特20%甘油以维持湿盒湿度,每张切片滴加20ul实杂交液,放进37℃恒温箱4小时,汲取多余液体,不浸；⑦杂交：每张切片滴加20μl杂交液,并盖上原位杂交专用盖玻片,然后连同湿盒放进42℃恒温箱内过夜；⑧杂交后洗净：从恒温箱放入湿盒,揭掉切片上的盖玻片,37℃水温的2×SSC洗净5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗净15分钟×1次；37℃0.2×SSC洗净15分钟×1次；⑨滴加封闭液：滴加后放进37℃恒温箱30分钟,甩去多余液体,不浸；⑩滴加生物素化鼠外用地高辛：滴加后放进37℃恒温箱1小时。用DEPC水处理过的原位杂交用PBS洗净5分钟×3次；滴加SABC：滴加后放进37℃恒温箱20分钟。

原位杂交用PBS洗净5分钟×3次；滴加生物素化过氧化物酶：滴加后放进37℃恒温箱20分钟。原位杂交用PBS洗净5分钟×4次；二氨基联苯胺(DAB)染剂：DAB染剂试剂盒-取1ml蒸馏水,往里重新加入显色剂Ａ,Ｂ,C各一滴,混匀后滴加在切片上,室温染剂10分钟,充份水洗；○14酒精水解,二甲苯半透明,中性树胶封片。镜检。

在高清晰光镜上行阳性细胞亲率检测[36]:在每个切片上随机所取5个视野,镜下仔细观察,胞质中有棕黄色颗粒即为阳性,计算出来出有阳性着色面积,然后利用单位面积内的总细胞数通过计算出来得出结论其中的阳性细胞数,再行将5个视野平均值,可以欲出有切片中阳性细胞比例,最后用阳性细胞的百分率%来回应TNF-a、TGF-β1、IFN-r的传达。实验数据中计数资料用χ2检验；计量资料则用X土s回应,使用F检验及SNK检验,应用于SPSS19.0统计资料软件来展开数据处理,若P。

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